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阿爾茨海默?。ˋD）是最主要的神經(jīng)退行性疾病，Aβ（特別是Aβ42）是導致AD的重要成因。γ-secretase在A(yíng)β的生成過(guò)程中發(fā)揮著(zhù)重要作用，因此一直被人們視作抗AD藥物研發(fā)的一個(gè)重要靶點(diǎn)。然而，分子量高達230kDa、多次跨膜且高度糖基化的γ-secretase給傳統結構解析方法提出了重大挑戰。近些年，施一公團隊應用Cryo-EM SPA技術(shù)以3.4 ?分辨率解析γ-secretase的結構，并進(jìn)一步解析了4種靶向藥物與γ-secretase結合形成復合物的結構，為新一代藥物的發(fā)現和優(yōu)化提供了重要啟示。
- 01 -
γ-secretase是抗AD藥物研發(fā)的重要靶點(diǎn)
阿爾茨海默?。?/span>Alzheimer’s Disease, AD）是全球最主要的神經(jīng)退行性疾病，患病人群的規模龐大。淀粉樣斑塊沉積是AD的兩大病理特征之一，這些斑塊主要由β-淀粉樣小肽（β-amyloid, Aβ）沉積形成。自1991年發(fā)現淀粉樣前體蛋白（Amyloid Precursor Protein, APP）突變參與家族性AD（FAD）發(fā)病以來(lái)，淀粉樣蛋白級聯(lián)假說(shuō)就逐漸成為AD發(fā)病機理的主流理論，而早老素1（Presenilin 1, PS1）突變體的發(fā)現進(jìn)一步支持了這一假說(shuō)[1]。
Aβ是APP經(jīng)由淀粉樣生成途徑被分泌酶切割產(chǎn)生的片段。在該途徑中，APP的N端在質(zhì)膜的胞外側首先被β-分泌酶（β-secretase）切割，然后其C端的99個(gè)氨基酸殘基（C99）會(huì )進(jìn)一步被γ-分泌酶（γ-secretase）切割，產(chǎn)生胞內域和一個(gè)包含48或49個(gè)殘基的跨膜區短肽（Aβ48或Aβ49）。Aβ48和Aβ49可繼續被γ-secretase以消化3或4個(gè)殘基的方式切割。其中Aβ49被切割后產(chǎn)生Aβ46，Aβ43和Aβ40。而Aβ48被切割后產(chǎn)生Aβ45，Aβ42和Aβ38[2]。人體中Aβ存在的最主要形式是Aβ40和Aβ42。由于這些Aβ片段幾乎包含了APP這一單次跨膜蛋白的整個(gè)跨膜區段而具有很強的疏水性，所以極易聚集并在體內形成淀粉樣纖維，進(jìn)而沉積形成淀粉樣斑塊。其中，Aβ42和Aβ43最容易聚集并產(chǎn)生神經(jīng)毒性，從而引起AD[3]。
圖1. Aβ單體主要在神經(jīng)元內體中產(chǎn)生并外排至細胞間質(zhì)中逐步聚集(Justin M. Long and David M. Holtzman1, 2019)
人源γ-secretase由Presenilin, Aph-1, Pen-2和Nicastrin共4個(gè)亞基組成，其中Presenilin構成了執行酶活性的功能亞基，它具有PS1和PS2兩個(gè)同源異構體。目前在PS1, PS2和APP上鑒定出200多個(gè)突變與AD相關(guān)，絕大部分都集中在PS1上[4]。這些突變中的大部分突變導致APP不正常切割，致使生成Aβ變多或者Aβ42/Aβ40的比率升高[5]。這些發(fā)現表明Aβ（特別是Aβ42）是導致AD的重要成因。在這個(gè)假設前提下，如能夠抑制或者調節γ-secretase的切割活性，或許能夠減少Aβ的產(chǎn)生，達到治療AD的目的[6]。因此理解γ-secretase的分子機理以及藥物對γ-secretase的作用機制極為關(guān)鍵。
- 02 -
冷凍電鏡單顆粒分析技術(shù)解決γ-secretase結構解析重大難題同其他多次跨膜膜蛋白一樣，科學(xué)家們在很長(cháng)時(shí)間內都無(wú)法得到生長(cháng)良好的γ-secretase蛋白晶體，因此很難通過(guò)X-Ray衍射這一傳統技術(shù)獲得γ-secretase的高分辨率結構。同時(shí)，面對分子質(zhì)量高達230kDa，具4個(gè)亞基且高度糖基化的成熟γ-secretase，NMR分析也同樣力不從心。2013年程亦凡教授與David Julius博士合作，率先應用冷凍電鏡單顆粒分析技術(shù)（Cryo-EM Single Particle Analysis, Cryo-EM SPA）解析了TRPV1蛋白結構[7]，并將其分辨率提升到近原子級別的3.4 ?，為Cryo-EM在結構領(lǐng)域的應用帶來(lái)了重大突破。同時(shí)也讓人們意識到，Cryo-EM很可能成為解決高分子量多次跨膜蛋白結構解析難題的新一代技術(shù)。
2015年，施一公團隊率先在Nature上發(fā)表文章，報告了應用Cryo-EM SPA技術(shù)解析的γ-secretase近原子級蛋白結構，分辨率達到?3.4 ?[8]。在2018-2019年，施一公團隊又先后在Nature和Science上發(fā)表文章，利用冷凍電鏡解析了人源γ-secretase識別并結合Notch和APP的結構基礎，關(guān)鍵區域分辨率分別達到2.7 ?和2.6 ?[9,10]。
圖2.?人源γ-secretase近原子級結構?(Bai.X.-C., et al. 2015)
- 03?-
冷凍電鏡高效解析候選藥物與γ-secretase復合物結構，領(lǐng)航新一代藥物研發(fā)
γ-分泌酶抑制劑（GSI）和調節劑（GSM）的開(kāi)發(fā)為AD提供了富有前景的治療機會(huì )。但這些GSI和GSM如何靶向γ-secretase仍然未知。2021年施一公團隊在Cell上發(fā)表新文章，再次應用Cryo-EM SPA解析了4種候選分子與γ-secretase復合物結構[11]。文章報告γ-secretase分別與3種GSI（Semagacestat, Avagacestat和過(guò)渡狀態(tài)類(lèi)似物L458）或1種GSM（E2012）結合復合物結構，分辨率2.6–3.1?，均達到近原子級別。值得注意的是，每個(gè)GSI在PS1上均占據底物位置，從而干擾底物的募集。而E2012可與γ-secretase別構位點(diǎn)結合，這可能解釋了其調節活性。這些基于冷凍電鏡的結構解析工作，有望指導基于藥物構效關(guān)系（Structure Activity Relationship, SAR）的下一代靶向γ-secretase藥物的開(kāi)發(fā)。
本研究首先在體外驗證了課題組純化的重組γ-secretase的活性，并使用Alpha Lisa Assay測量不同條件重組γ-secretase切割C99生成Aβ40的活性，用于評估3種GSI靶向Aβ生成的抑制作用。之后解析γ-secretase分別結合Semagacestat, Avagacestat，L458和E2012后形成的復合物電鏡結構。Semagacestat由Eli Lily開(kāi)發(fā)，是第一個(gè)進(jìn)入III期臨床評估的GSI[12]。與令人鼓舞的早期結果相反[13]，Semagacestat未顯示預期的認知改善，卻產(chǎn)生嚴重副作用[14]，這歸因于Semagacestat抑制了γ-secretase對Notch等其他重要底物的水解[15]。
圖3.?人源γ-secretase結合Semagacestat的結構基礎?(原文圖2)
結構解析結果顯示：Semagacestat的結合位點(diǎn)與APP-C99或Notch-100的β-鏈完全相同，位于PS1胞內側的深腔中（圖3, A）。該發(fā)現為Semagacestat抑制γ-secretase的活性提供了直接且令人滿(mǎn)意的解釋。Semagacestat占據該位點(diǎn)可能阻礙PS1和底物間雜化β-片層形成，從而抑制γ-secretase水解底物。Semagacestat與PS1的K380和L432的主鏈形成4個(gè)氫鍵（圖3, D左），這兩個(gè)殘基在γ-secretase識別C99或Notch -100時(shí)同樣發(fā)揮重要作用[9,10]，提示Semagacestat與PS1結合模式與PS1的天然底物相似。此外，Semagacestat上芳香環(huán)和甲基還與PS1疏水殘基的側鏈接觸并形成生范德華力，但仍然留下了幾個(gè)小縫隙（圖3）。若在這些縫隙中填充其他疏水基團，以填充Semagacestat與V261或V272周?chē)氖杷臻g，可能提高新一代抑制分子的特異性和抑制能力。
為了解決Semagacestat底物選擇性差、毒副作用顯著(zhù)的問(wèn)題，Avagacestat作為具有底物選擇性的GSI而被開(kāi)發(fā)。相比于Semagacestat，Avagacestat選擇性抑制PS1對C99的水解，作用比底物為Notch時(shí)強約3-193倍[16]。盡管如此，高劑量的Avagacestat仍然會(huì )抑制PS1對Notch的水解并顯示毒性。Avagacestat的結合模式如何賦予其底物選擇性是個(gè)非常有價(jià)值的研究問(wèn)題。復合物的結構顯示，雖然Avagacestat與Semagacestat的化學(xué)性質(zhì)完全不同，但Avagacestat與Semagacestat結合位點(diǎn)完全相同（圖4, B）。因此Avagacestat同樣占據PS1底物結合位點(diǎn)，阻止雜化β-片層的形成從而抑制γ-secretase的活性。
圖4.?人源γ-secretase結合Avagacestat的結構基礎?(原文圖3)
但Avagacestat的具體結合模式與Semagacestat存在很大的區別，這可能是其抑制作用底物選擇性的原因。Avagacestat主要與PS1疏水殘基互作，只與G382主鏈酰胺基形成1個(gè)氫鍵（圖4, C）。Avagacestat三氟戊酰胺基（圖4, A中Thumb區）位于PS1 N端（NTF）V261，L268和V272構成的疏水口袋（圖4, C左）。Avagacestat氯苯基（圖4, A中Index區）結合在PS1 C端（CTF）與L418，T421，L425和A434間形成范德華力（圖4, C右）。Avagacestat惡二唑氟芐基（圖4, A中Stem區）一側與PS1結合（圖3D，左），另一側在空間上相對裸露，因此可用于進(jìn)一步修飾（圖3D，右中綠色圈），以增強抑制強度和特異性。
與Semagacestat和Avagacestat不同，L458是一種競爭性過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物抑制劑（TSA）。L458直接結合PS1活性位點(diǎn)，在空間上大致與Semagacestat和Avagacestat相同（圖5, B）。?L458和位于催化中心的2個(gè)天冬氨酸（D257, D385）同時(shí)形成氫鍵，并與與PS1上的其他氨基酸形成另外的5個(gè)氫鍵（圖5, C），還能同周?chē)氖杷畾埢纬煞兜氯A力（圖5, D）。相較于非TSA抑制劑，L458可以與PS1催化位點(diǎn)上方的口袋進(jìn)一步結合，以加固抑制劑與催化殘基D257和D385之間的氫鍵。
圖5.?人源γ-secretase結合L458的結構基礎?(原文圖5)除GSI以外，GSM也被公認為是一類(lèi)有吸引力的小分子。GSM很可能會(huì )促進(jìn)Aβ42的進(jìn)一步切割，從而減少易于聚集的Aβ的產(chǎn)量[17]。與GSI不同，GSM在遠離活性位點(diǎn)的別構位點(diǎn)處識別并結合γ-secretase。這提示我們，特定GSI可與GSM配合使用并發(fā)揮協(xié)同作用，進(jìn)而實(shí)現底物選擇性抑制。2013年，Pozdnyakov等曾報道L458可以增強E2012與γ-secretase的結合力[17]。
體外孵育實(shí)驗表明，單獨使用5 nM的?L458或50 mM GSM E2012時(shí)僅導致γ-secretase水解C99活性的溫和抑制，而二者聯(lián)用卻能幾乎完全抑制水解（圖6, A）。為闡釋L458與E2012對γ-secretase活性調節的協(xié)同作用，團隊以2.6?的分辨率獲得了同時(shí)與E2012和L458結合的重組人源γ-secretase的冷凍電鏡結構。E2012插入PS1和NCT界面處的疏水口袋中，并與PS1的loop-1互作（圖6, C），覆蓋部分底物結合通道（圖6, D），從而調節γ-secretase對不同底物的活性。將結合E2012的γ-secretase與APP片段復合起來(lái)，發(fā)現E2012與C99的N端發(fā)生沖突（圖6, F&G），這種沖突可能使C99募集更困難或促進(jìn)C99的解旋退繞。后者可導致C99進(jìn)一步向下移動(dòng)到PS1活性位點(diǎn)，并增加將Aβ切割成較短片段的可能性。先前的研究也已證明：存在E2012時(shí)Aβ40和Aβ42產(chǎn)量降低，而Aβ38產(chǎn)量升高[17]。
圖6.?人源γ-secretase結合E2012的結構基礎?(原文圖5)
- 總結 -
時(shí)至今日，科學(xué)家們?yōu)榱斯タ薃D已經(jīng)積累了幾十年的努力。然而我們尚未發(fā)現任何一種手段可以有效緩解疾病，甚至連延緩認知障礙的進(jìn)展都很難做到。這在很大的程度上和AD病因不完全明確、相關(guān)生物大分子的結構和功能尚未被完全闡明有關(guān)。施一公團隊這項工作應用Cryo-EM SPA技術(shù)，在近原子分辨率上解析了γ-secretase與多種小分子結合后形成復合物的結構。有關(guān)結果一方面進(jìn)一步揭示了現有先導化合物或第一代藥物分子的作用機制，另外一方面也可以啟發(fā)研發(fā)人員基于結構對藥物分子進(jìn)行優(yōu)化設計。隨著(zhù)技術(shù)的不斷進(jìn)步，Cryo-EM SPA技術(shù)的解析分辨率已經(jīng)可以達到3?以下，有關(guān)文章在近年也呈現爆發(fā)式增長(cháng)。今后，冷凍電鏡必將成為藥物發(fā)現和優(yōu)化的強大助力，為守護人類(lèi)健康做出更大貢獻。
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