正如該系列第一篇文章“基因治療里的七龍珠”中所提到的，一款基因治療藥物要想成功面市，必需經(jīng)過(guò)七大步驟。從疾病相關(guān)基因的表達調控，到基因遞送載體的選擇，再到藥物上市審批，每一步都至關(guān)重要，且極具挑戰性?！奥仿湫捱h兮，吾將上下而求索”，在這條收集七龍珠的道路上，一個(gè)又一個(gè)“孫悟空”為實(shí)現基因治療的理想而努力探索。本節，我們將“溯洄從之”，談一談基因治療的歷史，看看從基礎技術(shù)積累到基因治療概念的提出，再到第一例臨床實(shí)驗被批準，基因治療技術(shù)是如何一步步由理論變?yōu)楝F實(shí)的。
▲?圖1.基因治療技術(shù)的發(fā)展脈絡(luò )
1952年，Joshua Lederberg（約舒亞 · 萊德伯格，1958年諾貝爾生理學(xué)或醫學(xué)獎獲得者）和Norton Zinder（諾頓 · 津德?tīng)枺┌l(fā)表了名為《Genetic exchange in Salmonella》的文章。他們通過(guò)噬菌體將一段鼠傷寒沙門(mén)氏菌的DNA轉移到了另一個(gè)細菌，從而確定細菌除了轉化和結合外（轉化是指受體菌直接攝取供體菌的DNA片段而獲得新的遺傳性狀的過(guò)程；結合是指供體菌和受體菌通過(guò)細胞間的暫時(shí)溝通，將遺傳物質(zhì)自供體轉入受體，使受體獲得供體部分遺傳性狀，由Joshua Lederberg和Tatum在1946年發(fā)現。），還存在第三種遺傳物質(zhì)的轉移方式：通過(guò)病毒粒子將基因從一種微生物轉移到另一種微生物，他們稱(chēng)之為“轉導”。自此人們有了對病毒可以轉移遺傳物質(zhì)的認識，并很快將其擴展應用到真核生物，這奠定了病毒作為基因載體工具的基礎，基因治療中的“長(cháng)征一號”開(kāi)始有了草圖。
▲?圖2.普遍性轉導的過(guò)程
在1953年，生物學(xué)界出現了一個(gè)具有劃時(shí)代意義的發(fā)現：Watson（沃森）和 Crick（克里克）提出了DNA的雙螺旋結構模型，確定A（腺嘌呤）與T（胸腺嘧啶）配對、G（鳥(niǎo)嘌呤）與C（胞嘧啶）配對，由此開(kāi)啟了分子生物學(xué)時(shí)代。在這之后，DNA半保留復制、中心法則等相繼被提出，為基因工程的探索提供了理論依據，也奠定了基因治療中重要的一環(huán) ——“基因表達與調控”的基礎。
1962年，Waclaw Szybalski(瓦克勞·斯吉巴爾斯基)發(fā)表文章《DNA-mediated heritable transformation of a biochemical trait》。他通過(guò)在D98S細胞的兩種衍生物HGRPT(+)型細胞和HGRPT(-)型細胞之間進(jìn)行DNA轉導，并在HAT培養基中篩選，發(fā)現將HGRPT(+)型的D98S細胞的DNA導入HGRPT(-)型的D98S細胞后，原本不能在HAT培養基中存活的HGRPT(-)型細胞可以正常存活增值了。該研究結果成為哺乳動(dòng)物細胞中遺傳基因轉移的第一個(gè)有記錄的證據，證明遺傳缺陷可以通過(guò)外源的DNA來(lái)修復。為基因治療提供了進(jìn)一步的理論基礎。
▲?圖3.D98S細胞的遺傳基因轉移實(shí)驗
在生物學(xué)領(lǐng)域新發(fā)現、新事物層出不窮的背景下，Edward Tatum（愛(ài)德華·塔特姆）和Joshua Lederberg在1963年提出可利用病毒作為基因轉移載體，進(jìn)行細胞的基因交換和基因優(yōu)化。
1966年，Edward Tatum在《Molecular biology, nucleic acids, and the future of medicine》中寫(xiě)道：“These will come by epidemiological, immunological, and chemotherapeutic means, by modification and regulation of gene activities, orby means of?gene repair or replacement.”。預測基因修復和替代將在疾病治療中有極大的前途和作用。并且提到，在關(guān)鍵酶、基因編碼以及合適的方法確立后，基因就可以在體外有序的合成。再加上已有的DNA攝取和整合技術(shù)，基因工程的實(shí)現便指日可待了！
但是此時(shí)這只是科學(xué)家們暢想的美好藍圖，就連Gene Therapy這個(gè)名詞都還沒(méi)有出現，顯然在技術(shù)積累上還需要繼續蓄力。正如最初的電子計算機ENIAC（埃尼阿克）發(fā)展成如今的電腦，需要有更多的關(guān)鍵性新技術(shù)和新工具出現。
迷途中實(shí)踐-第一個(gè)吃螃蟹的人
1968年，Stanfield Rogers(斯坦菲爾德· 羅杰斯)等人用TMV（煙草花葉病毒）作為載體，將聚腺苷酸延伸到病毒RNA上，首次證明了經(jīng)過(guò)人工修飾的基因可以通過(guò)病毒載體來(lái)介導其轉移。在這一結果的基礎上，他于1970年進(jìn)行了第一次人體基因治療試驗。之前已有研究發(fā)現，兔感染SPV（肖普乳頭狀瘤病毒）可以使其皮膚長(cháng)出肉疣，體內會(huì )生成精氨酸酶，導致兔血清中精氨酸水平下降。所以他們推測SPV攜帶編碼精氨酸酶的基因，于是他們嘗試通過(guò)體內注射野生型SPV來(lái)治療兩個(gè)患有精氨酸酶缺乏癥的女孩。但是不幸的是，試驗的結果是陰性的，患者血清精氨酸水平并未監測到明顯變化。后來(lái)，在對SPV基因組進(jìn)行測序后，發(fā)現SPV基因組實(shí)際上并不編碼精氨酸酶。此次試驗是在對患者基因型、病毒載體特性等方面都不清楚的情況下進(jìn)行的，更不存在藥品監管部門(mén)的審批，不得不說(shuō)是非常大膽且危險的行為，幸而沒(méi)有對患者造成更多的傷害。但從中不難看出患者對治療藥物迫切的需求以及科學(xué)家對基因治療積極的探索，只是原理還沒(méi)有清晰，尤其是對基因表達及調控的復雜程度缺乏清晰的認知，技術(shù)還遠不成熟，倫理監管仍需嚴格把關(guān)。
快還是慢- Gene Therapy如何抉擇
20世紀七八十年代是基因工程飛速發(fā)展的階段，一系列與基因修飾和合成相關(guān)的酶被發(fā)現：包括限制性?xún)惹忻?、DNA連接酶和逆轉錄酶等。這些酶的發(fā)現促成了第一個(gè)重組DNA分子的產(chǎn)生，促成了在大腸桿菌體內表達葡萄球菌乃至哺乳動(dòng)物的基因，同時(shí)也為病毒載體介導的基因治療技術(shù)發(fā)展帶來(lái)了信心。所有人都在熱切盼望技術(shù)成功的那一天。
“Gene Therapy for Human Genetic Disease? ”Theodore Friedmann（西奧多·弗里德曼） 1972年在 Science 上發(fā)表了一篇評論，第一次提出了基因治療的概念，同時(shí)也表達了對基因治療未來(lái)發(fā)展的憧憬和擔憂(yōu)。在當時(shí)，已知由基因缺陷導致的遺傳病就有1500多種，而且大部分是罕見(jiàn)病，他們面對的是更少的研究投入和更渺茫的治愈可能。用外源的“good”基因代替有缺陷的基因，通過(guò)基因治療的手段去治療疾病，將給這些患者帶來(lái)福音。然而，雖然基因治療的概念藍圖早已被畫(huà)出，但是病毒載體的修飾、基因表達的調控（靶向性，整合效率等）、免疫原性等問(wèn)題都是不得不去思考和重視的關(guān)鍵因素。他提倡建立倫理-科學(xué)的標準，來(lái)規范和約束大家的激進(jìn)嘗試：（1）清楚疾病發(fā)生原因；（2）考慮病人的異質(zhì)性，看似癥狀相同的遺傳疾病在不同的個(gè)體中具有不同的遺傳方式；（3）外源性DNA載體質(zhì)量和安全性保證；（4）在實(shí)驗動(dòng)物上進(jìn)行廣泛的研究；（5）對于某些遺傳性疾病，先利用體外培養的患者皮膚成纖維細胞做測試?；蛑委熥罱K目標是盡可能實(shí)現患者的利益，使用之前要充分評估其風(fēng)險，因此病因和治療機制必須明確，不成熟地應用不被充分理解的技術(shù)，會(huì )造成嚴重的后果?？傊畟惱淼囊幏?、科學(xué)的依據才是基因治療實(shí)現應用的前提。
快就是慢- 一次失敗的實(shí)驗
1979年， Martin Cline（馬丁·克萊因）利用磷酸鈣轉染的方式，成功將人免疫球蛋白基因導入小鼠的骨髓細胞，用于免疫球蛋白基因缺陷小鼠的治療。除此之外，他還將外源基因(二氫葉酸還原酶和單純皰疹病毒胸苷激酶)導入小鼠骨髓干細胞，而這些修飾過(guò)的細胞能夠在其他小鼠的骨髓中部分再生。受到這些結果的鼓舞，1980年Martin Cline打算在病人身上測試這種治療方法，他向UCLA (加州大學(xué)洛杉磯分校)申請使用同樣的方法治療β-地中海貧血患者。在本系列之前的文章中已經(jīng)提到過(guò)，β-地中海貧血是由于血紅蛋白中β –珠蛋白的缺失（缺陷）造成的，通常會(huì )導致嚴重的甚至危及生命的貧血，當時(shí)對此唯一的治療方案是依賴(lài)于頻繁輸血。之所以選擇地中海貧血是由于人們對它的研究較多，以為其發(fā)病機制已比較清楚（實(shí)際上地貧的病因和治療極其復雜）。然而，他的申請并沒(méi)有得到審查委員會(huì )的許可，但是他還是啟動(dòng)了這項研究！從兩名β-地中海貧血重癥患者身上抽取了骨髓細胞，并對其進(jìn)行改造和回輸，一名患者在意大利接受治療，另一名在以色列接受治療。但是很可惜這次試驗因為沒(méi)有使患者的臨床癥狀得到緩解而宣告失敗，Martin Cline也因開(kāi)展未經(jīng)批準的人體實(shí)驗受到了嚴厲處罰和廣泛指責。這次試驗是第一次嘗試利用重組DNA進(jìn)行基因治療，雖然已經(jīng)意識到對細胞進(jìn)行基因修飾在基因治療中的重要性，但顯然低估了其復雜性。此次事件后，體細胞基因治療一度受到冷落。
進(jìn)入春天-?監管下的基因治療
直到1988年12月，RAC (重組DNA咨詢(xún)委員會(huì )) 正式批準了Steven Rosenberg（史蒂文 ? 羅森伯格)關(guān)于將外源基因導入人體的臨床方案。在之前的研究中，Rosenberg發(fā)現通過(guò) TILs (腫瘤浸潤性淋巴細胞)和白介素-2可以治療轉移性黑色素瘤，于是他從轉移性黑色素瘤患者身上提取了TILs，并利用逆轉錄病毒作為載體對其進(jìn)行了抗性標記，想要探究TILs浸潤和它們對腫瘤治療的有效性之間是否存在臨床相關(guān)性。后來(lái)再看，這次試驗僅是用一個(gè)報告基因構建的表達載體，了解標記基因在人體內的分布和表達情況，可以看作一個(gè)基因治療對照實(shí)驗，并不是真正的基因治療。
1990年，史上最早被正式批準的基因治療人體試驗開(kāi)始了。William French Anderson(威廉·弗蘭奇·安德森)醫生領(lǐng)銜開(kāi)展了針對重癥聯(lián)合免疫缺陷?。⊿CID）的基因治療。SCID是由ADA（腺苷脫氨酶）缺陷或白介素受體(IL-2R最常見(jiàn))功能障礙所致。ADA-SCID為常染色體隱性遺傳病，兩條染色體上的ADA基因都發(fā)生了突變，導致ADA蛋白缺失，從而引起細胞損傷或死亡，致細胞體液免疫缺陷，人體內的免疫T細胞會(huì )很快死去，這相當于身體對細菌和病毒開(kāi)放，非常危險。兩名ADA-SCID的患病兒童接受了此次基因治療，研究人員從患兒血液中提取了白細胞，并在體外利用逆轉錄病毒載體將能夠正確編碼ADA的基因插入患者的白細胞基因組中，然后進(jìn)行白細胞回輸。之后的檢測表明， 其中一位受試者Ashanti DeSilva（阿莎提·德席爾瓦）體內的白細胞確實(shí)可以正確地合成ADA了，在6個(gè)月后她的T細胞水平便恢復了正常值。盡管這種藥物顯著(zhù)減輕了Ashanti的癥狀，但是并沒(méi)有完全治愈她，直到現在她仍需定期接受 PEG-ADA (聚乙二醇腺嘌呤脫氨酶)的替代治療，因此人們對本次基因治療的效果仍存在一些爭議。但無(wú)論如何這次試驗意義重大，是一個(gè)典型的成功案例，也讓基因治療正式走進(jìn)了普通大眾的視野，基因治療在理論、技術(shù)、政策上全面的進(jìn)入了春天。
▲?圖4.?Anderson醫生和Ashanti
60年代到90年代，從提出基因優(yōu)化的概念到第一例臨床實(shí)驗的審批，短短三十年的時(shí)間，基因治療便從理論走向現實(shí)；而后從1990年直到現在，又是三十年過(guò)去了，后續的研究應用又是如何站在巨人的肩膀上昂首向前的？基因治療“道阻且長(cháng)”，但我們充滿(mǎn)期待與信心，且看下回再與您共同回顧！
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